Прорыв гематоэнцефалического барьера после острой гипоксии головного мозга у детей

ВВЕДЕНИЕ / INTRODUCTION

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) – это физиологический барьер, отделяющий кровоток от центральной нервной системы (ЦНС). Он состоит из эндотелиальных клеток, астроцитов и перицитов, которые составляют структурную основу ГЭБ. Взаимосвязанные эндотелиальные клетки в сосудах головного мозга имеют решающее значение для основной функции ГЭБ – поддержания гомеостаза мозга и защиты нервной ткани от циркулирующих токсинов, микроорганизмов и факторов иммунной системы, которые могут воспринимать ткань мозга как чужеродную [1][2].

К потенциальным исходам перинатального гипоксическиишемического поражения ЦНС относятся такие состояния, как гидроцефалия, микроцефалия, детский церебральный паралич, эпилепсия, задержка психомоторного развития. Однако определение тяжести и прогноза данных последствий связано с методологическими проблемами. Нарушение ГЭБ является значимым фактором развития многих неврологических нарушений и может способствовать хронизации патологических процессов при отсутствии своевременной реабилитационной поддержки [3–5]. Но факторы, приводящие к такой хронизации нейродегенеративных процессов, еще до конца не изучены. Поэтому состояние ГЭБ при гипоксически-ишемическом поражении ЦНС остается предметом постоянных научных исследований. Одним из таких «барьерных» антигенов является нейронспецифическая енолаза (НСЕ), которая обнаруживается в большинстве нейронов.

Фермент НСЕ, участвующий в гликолизе, существует в виде различных димерных изоферментов (αα, αβ, αγ, ββ и γγ), состоящих из субъединиц α, β и γ [6][7]. Обширные исследования НСЕ проводились в 1970–80-х гг., в результате чего было получено множество экспериментальных и клинических данных по ее анализу в биологических жидкостях при различных патологических состояниях [8–10]. В настоящее время НСЕ является единственным известным универсальным маркером дифференцированных нейронов и классифицируется как внутриклеточный фермент ЦНС. Качественная и количественная оценка НСЕ в сыворотке крови может дать ценную информацию о степени повреждения нейронов и нарушения ГЭБ при заболеваниях с непосредственным поражением нервной ткани [11]. Кроме того, исследования показывают, что активность НСЕ выше, когда патологический процесс затрагивает мембраны головного мозга, по сравнению с повреждением, ограниченным паренхимой головного мозга. Эти результаты подтверждают, что НСЕ является специфическим маркером повреждения нервной системы, особенно при гипоксии.

Поражение нейронов, в т.ч. при гипоксически-ишемическом поражении ЦНС, приводит к выбросу НСЕ в периферический кровоток. Поэтому НСЕ можно рассматривать как биологический маркер поражения нервной системы. По данным исследований, нарушение проницаемости ГЭБ может привести к отсроченной гибели нейронов и повреждению глиальных клеток даже после прекращения первоначального патологического воздействия, в частности гипоксии [12][13]. Кроме того, трофическая функция ГЭБ играет роль в определении размеров зоны гипоксически-ишемического повреждения [14]. Другим фактором, способствующим расширению этих зон и хронизации нейродегенеративных процессов, является проникновение «забарьерных» антигенов в периферический кровоток через поврежденный ГЭБ, что затем запускает механизмы иммунного ответа [15].

В исследованиях изучались особенности динамики уровня НСЕ в периферическом кровотоке у детей с перинатальным гипоксически-ишемическим поражением ЦНС в течение первых 24 нед жизни. Эти работы подтвердили статистически значимое увеличение концетрации НСЕ в 1-ю и 4-ю недели после рождения [16]. Однако данные ранее не были стратифицированы по гестационному возрасту. Хотя существует некоторая информация о различиях сывороточных концентрациях нейроспецифических белков у недоношенных детей разного гестационного возраста по сравнению с контрольной группой в течение первых 3 нед после рождения, сведения об отдаленной динамике концентрации НСЕ пока ограничены [17]. Поэтому публикация результатов анализа первичных данных, полученных в ходе клинических исследований, имеет ценность как с научной, так и с практической точки зрения.

Цель – ретроспективно оценить изменения содержания НСЕ в периферической крови на протяжении 24 нед у детей различного гестационного возраста, перенесших перинатальное гипоксически-ишемическое поражение ЦНС.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ / MATERIAL AND METHODS

Дизайн исследования / Study design

В исследовании приняли участие 77 детей.В контрольную группу включены 28 здоровых доношенных детей, рожденных от здоровых матерей с нормально протекавшими беременностью и родами. Гестационный возраст варьировался от 38 до 41 нед. В основную группу (с перинатальным гипоксически-ишемическим поражением ЦНС) вошли 49 новорожденных, сроки беременности составили от 32 до 41 нед.

По шкале Апгар 49 детей с перинатальным гипоксически-ишемическим повреждением были разделены на три подгруппы: 23 новорожденных с оценкой по шкале Апгар 1–3 на 1-й минуте после рождения (подгруппа А1–3), 18 с оценкой 4–6 баллов (подгруппа А4–6) и 8 с оценкой 7–9 баллов (подгруппа А7–9).

Также пациенты были разделены на категории по массе тела и гестационному возрасту (ГВ), в результате чего было выделено три подгруппы: 12 детей со сроком беременности 32–33 нед (подгруппа ГВ32–33), 15 со сроком беременности 34–36 нед (подгруппа ГВ34–36) и 22 со сроком беременности 38–40 нед (подгруппа ГВ38–40).

На основании результатов нейросонографии были сформированы еще две подгруппы: с преимущественно геморрагическим поражением ЦНС с внутрижелудочковыми кровоизлияниями (подгруппа ВЖК, n=14) и с преимущественно ишемическим поражением с перивентрикулярными лейкомаляциями (подгруппа ПВЛ, n=7).

Методы обследования / Examination methods

Всем новорожденным проводили клинический осмотр с последующим присвоением баллов по шкале Апгар. Оценку внутренних структур головного мозга осуществляли методом нейросонографии. Тяжесть перинатального гипоксически-ишемического поражения ЦНС определяли согласно классификации перинатальных поражений нервной системы у новорожденных [18].

Количественный анализ концентрации НСЕ в сыворотке крови выполняли методом иммуноферментного анализа со специфическими тест-системами на основе моноклональных антител. Результаты записывали с помощью одноканального фотометра, а уровни НСЕ сравнивали в исследуемых подгруппах и контрольной группе.

Терапия / Therapy

Все дети в тяжелом состоянии получали лечение в отделении интенсивной терапии, которое включало различные методы: искусственная вентиляция легких, инфузионная, антибактериальная терапия и глюкокортикоидная терапия. Также они проходили комплексную синдромальную терапию с тщательным контролем состава крови и уровня различных веществ.

Статистический анализ / Statistical analysis

Подготовку данных и последующую статистическую обработку проводили в программах Microsoft Office Excel (Microsoft, США) и Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США). Для проверки нормальности распределения использовали критерий Шапиро–Уилка. Наличие выбросов проверяли методом трех сигм. Тест показал нормальность распределения обрабатываемых выборок. Все результаты измерений представлены в тексте и графиках в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±σ). Сравнение между группами в каждой временной точке выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа (англ. analysis of variance, ANOVA) и теста Тьюки. Различия считали значимыми при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ / RESULTS

Общая характеристика новорожденных / Overall characteristics of newborns

В контрольной группе состояние детей при рождении было удовлетворительным, баллы по шкале Апгар варьировались от 8 до 10. В основной группе при рождении у 23 (46,9%) новорожденных было тяжелое состояние, у 18 (36,7%) − средней тяжести, у 8 (16,3%) − удовлетворительное.

У всех детей основной группы были отмечены проявления перинатального гипоксически-ишемического повреждения: у 10 (20,4%) − I степени, у 32 (65,3%) − II степени, у 7 (14,3%) − III степени. У некоторых новорожденных также наблюдались респираторный дистресс-синдром, внутриутробная пневмония, конъюгационная гипербилирубинемия различных степеней, общий отечный синдром и внутриутробная недостаточность питания. С помощью нейросонографии подтверждены внутрижелудочковые кровоизлияния и перивентрикулярная лейкомаляция у 21 ребенка.

Соотношение уровня НСЕ с состоянием новорожденных / Interrelation of NSE level with newborns’ condition

В контрольной группе концентрация НСЕ в сыворотке крови не колебалась более 2,7±0,5 нг/мл в течение 24-недельного периода наблюдения. Однако в подгруппах А1–3, А4–6 и А7–9 отмечены статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой на протяжении всего исследования (р<0,05), за исключением подгруппы А7–9 на 24-й неделе.

Примечательно, что значительные различия наблюдались между подгруппами А1–3 и А4–6 в течение 2-й и 3-й недель. После незначительного снижения на 4-й неделе концентрация НСЕ в сыворотке крови детей этих подгрупп вернулась к прежним значениям, составив 35,5±5,9 и 32,2±4,8 нг/мл соответственно. У новорожденных из подгруппы А7–9 также зафиксирована тенденция к увеличению уровня НСЕ, хотя и в меньшей степени, чем в подгруппах А1–3 и А4–6. С течением времени концентрация НСЕ в этой подгруппе постепенно снижалась до нормальных значений, тогда как в подгруппах А1–3 и А4–6 она оставалась повышенной до конца исследования. Подробные результаты представлены на рисунке 1.

Соотношение уровня НСЕ с гестационным возрастом / Interrelation of NSE level with gestational age

У детей, перенесших перинатальное гипоксически-ишемическое поражение ЦНС на 32–33-й неделе беременности (подгруппа ГВ32–33), сывороточная концентрация НСЕ составила 43,4±45 нг/мл в течение 1-й недели. Для сравнения, у новорожденных в подгруппах ГВ34–36 и ГВ37–41 уровни НСЕ были ниже – 26,6±3,0 и 25,1±1,5 нг/мл соответственно. В контрольной группе концентрация НСЕ в сыворотке крови в течение 1-й недели составляла всего 2,5±0,5 нг/мл.

В ходе исследования концентрация НСЕ в подгруппе ГВ32–33 оставалась достоверно выше, чем в контрольной группе, а также в подгруппах ГВ34–36 и ГВ37–41. Однако к концу исследования различия в уровнях НСЕ между подгруппами ГВ34–36 и ГВ37–41 и контрольной группой уже не были статистически значимыми. С 1-й недели наблюдения во всех подгруппах отмечено постепенное снижение показателей содержания НСЕ в сыворотке крови. Однако в подгруппе ГВ32–33 оно прервалось начиная с 3-й недели, а в подгруппах ГВ34–36 и ГВ 37–40 – начиная со 2-й недели: показатели снова увеличились, достигнув наивысшей точки на 4-й неделе. В то же время в подгруппе ГВ32–33 отмечался более выраженный отсроченный рост концентрации НСЕ, который превысил даже исходный уровень и достиг 45,1±3,5 нг/мл.

В дальнейшем во всех подгруппах концентрация НСЕ в сыворотке крови снова снизилась. Однако на 24-й неделе в подгруппе ГВ32–33 продолжало сохраняться статистически значимое повышение уровня НСЕ по сравнению с контрольной группой. Подробные данные приведены на рисунке 2.

Соотношение уровня НСЕ с видом повреждения ЦНС / Interrelation of NSE level with type of CNS damage

На протяжении всего исследования наблюдалась разница в сывороточной концентрации НСЕ между подгруппой ВЖК, подгруппой ПВЛ и контрольной группой (p<0,05). У новорожденных из подгруппы ВЖК указанные различия носили значимый характер в течение всего эксперимента. Однако в подгруппе ПВЛ различия уровней НСЕ по сравнению с контрольной группой не были статистически значимыми на 2-й, 8-й и 24-й неделях исследования (рис. 3).

Не менее интересной представляется динамика изменения сывороточной концентрации НСЕ в данных подгруппах. Вслед за начальным снижением уровня НСЕ на 2-й неделе жизни, наблюдавшимся в подгруппах ВЖК и ПВЛ, он снова повышался начиная с 3-й недели, достигнув пика на 4-й неделе. В подгруппе ВЖК концентрация НСЕ в сыворотке крови вернулась к исходным значениям 35,0±4,9 нг/мл. Однако в подгруппе ПВЛ пиковая концентрация НСЕ была менее выражена, составляя в среднем 11,8±2,2 нг/мл. В дальнейшем уровень НСЕ в подгруппе ПВЛ постепенно снижался, достигнув нормальных значений к концу исследования. Напротив, в подгруппе ВЖК по сравнению с контрольной группой сохранялись статистически значимые различия в сывороточных концентрациях НСЕ.

ОБСУЖДЕНИЕ / DISCUSSION

В настоящее время существуют проблемы в оценке эффективности медицинских вмешательств и программ реабилитации пациентов с поражением ЦНС. При этом своевременно оказанная реабилитационная поддержка таких больных может не только существенно улучшить качество жизни, но и снизить нагрузку на систему здравоохранения в дальнейшем [19]. Для анализа результатов лечения часто используются суррогатные конечные точки, такие как изменения структурных и функциональных показателей и биологических маркеров. Концентрация НСЕ в сыворотке крови может служить суррогатной конечной точкой при оценке реабилитационных технологий после гипоксически-ишемических поражений ЦНС. Диагностическая значимость НСЕ уже подтверждена в крупных клинических исследованиях [20][21].

В нашем исследовании установлено, что тяжесть перинатального поражения ЦНС обратно пропорциональна гестационному возрасту, что может быть связано с незрелостью органов и систем у недоношенных новорожденных, а также осложнениями внутриутробного развития. Обнаружено, что недоношенные дети имеют более низкую резистентность ГЭБ к поражениям ЦНС по сравнению с детьми с нормальным периодом беременности [22]. Другим клинически значимым изменением является отсроченное повторное повышение проницаемости ГЭБ для НСЕ, наблюдаемое через 4 нед после его выхода в периферический кровоток в 1-ю неделю жизни. Это соответствует экспериментальным исследованиям на лабораторных животных с моделью гипоксически-ишемического поражения ЦНС, где наблюдалось повторное и отсроченное увеличение нейроспецифических белков, маркеров нейронов и глии [23][24]. Данный феномен можно объяснить проникновением аутоантител к НСЕ через поврежденный ГЭБ к нейронам и закреплением хронически протекающего нейродегенеративного процесса. Функциональная целостность ГЭБ частично сохраняется при патологии нейронов, что ограничивает выход НСЕ в периферический кровоток.

Практический интерес также представляют различия в профилях высвобождения НСЕ у детей с ВЖК и ПВЛ. Концентрации НСЕ в сыворотке крови у новорожденных с ВЖК были стабильно в 2–3 раза выше, чем у детей с ПВЛ на протяжении всего периода наблюдения. К 8-й неделе уровни НСЕ в подгруппе ПВЛ были аналогичны таковым в контрольной группе. В исследовании рассматривались подгруппы детей, перенесших перинатальное гипоксически-ишемическое поражение ЦНС. На протяжении всего исследования более высокие уровни НСЕ в сыворотке были связаны с более тяжелым перинатальным гипоксически-ишемическим повреждением, о чем свидетельствует оценка по шкале Апгар.

Представленные данные демонстрируют наличие взаимосвязи между уровнем НСЕ и тяжестью состояния новорожденного. Закономерным будет рассмотреть возможность использования указанного биомаркера на еще более раннем периоде наблюдения. Так, результаты отдельных исследований указывают на высокую диагностическую значимость НСЕ в околоплодных водах. Этот биомаркер может служить маркером повреждения нейронов и коррелирует с такими расстройствами, как ВЖК и ПВЛ у плода [25][26]. Однако необходимо провести ряд подтверждающих исследований для широкого внедрения определения уровня НСЕ на этапе беременности, что поможет своевременно оказывать новорожденным должную реабилитационную поддержку.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ / CONCLUSION

Результаты исследования позволяют предположить, что нарушение проницаемости ГЭБ происходит при перинатальном гипоксически-ишемическом повреждении ЦНС. Антиген НСЕ выходит за пределы ГЭБ и служит маркером повреждения нейронов. Его концентрация в сыворотке крови может быть измерена для определения степени и характера поражения ЦНС, а также для оценки эффективности реабилитационных методов.