Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) – это физиологический барьер, отделяющий кровоток от центральной нервной системы (ЦНС). Он состоит из эндотелиальных клеток, астроцитов и перицитов, которые составляют структурную основу ГЭБ. Взаимосвязанные эндотелиальные клетки в сосудах головного мозга имеют решающее значение для основной функции ГЭБ – поддержания гомеостаза мозга и защиты нервной ткани от циркулирующих токсинов, микроорганизмов и факторов иммунной системы, которые могут воспринимать ткань мозга как чужеродную [1][2].

К потенциальным исходам перинатального гипоксическиишемического поражения ЦНС относятся такие состояния, как гидроцефалия, микроцефалия, детский церебральный паралич, эпилепсия, задержка психомоторного развития. Однако определение тяжести и прогноза данных последствий связано с методологическими проблемами. Нарушение ГЭБ является значимым фактором развития многих неврологических нарушений и может способствовать хронизации патологических процессов при отсутствии своевременной реабилитационной поддержки [3–5]. Но факторы, приводящие к такой хронизации нейродегенеративных процессов, еще до конца не изучены. Поэтому состояние ГЭБ при гипоксически-ишемическом поражении ЦНС остается предметом постоянных научных исследований. Одним из таких «барьерных» антигенов является нейронспецифическая енолаза (НСЕ), которая обнаруживается в большинстве нейронов.

Фермент НСЕ, участвующий в гликолизе, существует в виде различных димерных изоферментов (αα, αβ, αγ, ββ и γγ), состоящих из субъединиц α, β и γ [6][7]. Обширные исследования НСЕ проводились в 1970–80-х гг., в результате чего было получено множество экспериментальных и клинических данных по ее анализу в биологических жидкостях при различных патологических состояниях [8–10]. В настоящее время НСЕ является единственным известным универсальным маркером дифференцированных нейронов и классифицируется как внутриклеточный фермент ЦНС. Качественная и количественная оценка НСЕ в сыворотке крови может дать ценную информацию о степени повреждения нейронов и нарушения ГЭБ при заболеваниях с непосредственным поражением нервной ткани [11]. Кроме того, исследования показывают, что активность НСЕ выше, когда патологический процесс затрагивает мембраны головного мозга, по сравнению с повреждением, ограниченным паренхимой головного мозга. Эти результаты подтверждают, что НСЕ является специфическим маркером повреждения нервной системы, особенно при гипоксии.

Поражение нейронов, в т.ч. при гипоксически-ишемическом поражении ЦНС, приводит к выбросу НСЕ в периферический кровоток. Поэтому НСЕ можно рассматривать как биологический маркер поражения нервной системы. По данным исследований, нарушение проницаемости ГЭБ может привести к отсроченной гибели нейронов и повреждению глиальных клеток даже после прекращения первоначального патологического воздействия, в частности гипоксии [12][13]. Кроме того, трофическая функция ГЭБ играет роль в определении размеров зоны гипоксически-ишемического повреждения [14]. Другим фактором, способствующим расширению этих зон и хронизации нейродегенеративных процессов, является проникновение «забарьерных» антигенов в периферический кровоток через поврежденный ГЭБ, что затем запускает механизмы иммунного ответа [15].

В исследованиях изучались особенности динамики уровня НСЕ в периферическом кровотоке у детей с перинатальным гипоксически-ишемическим поражением ЦНС в течение первых 24 нед жизни. Эти работы подтвердили статистически значимое увеличение концетрации НСЕ в 1-ю и 4-ю недели после рождения [16]. Однако данные ранее не были стратифицированы по гестационному возрасту. Хотя существует некоторая информация о различиях сывороточных концентрациях нейроспецифических белков у недоношенных детей разного гестационного возраста по сравнению с контрольной группой в течение первых 3 нед после рождения, сведения об отдаленной динамике концентрации НСЕ пока ограничены [17]. Поэтому публикация результатов анализа первичных данных, полученных в ходе клинических исследований, имеет ценность как с научной, так и с практической точки зрения.

Цель – ретроспективно оценить изменения содержания НСЕ в периферической крови на протяжении 24 нед у детей различного гестационного возраста, перенесших перинатальное гипоксически-ишемическое поражение ЦНС.

В исследовании приняли участие 77 детей.В контрольную группу включены 28 здоровых доношенных детей, рожденных от здоровых матерей с нормально протекавшими беременностью и родами. Гестационный возраст варьировался от 38 до 41 нед. В основную группу (с перинатальным гипоксически-ишемическим поражением ЦНС) вошли 49 новорожденных, сроки беременности составили от 32 до 41 нед.

По шкале Апгар 49 детей с перинатальным гипоксически-ишемическим повреждением были разделены на три подгруппы: 23 новорожденных с оценкой по шкале Апгар 1–3 на 1-й минуте после рождения (подгруппа А1–3), 18 с оценкой 4–6 баллов (подгруппа А4–6) и 8 с оценкой 7–9 баллов (подгруппа А7–9).

Также пациенты были разделены на категории по массе тела и гестационному возрасту (ГВ), в результате чего было выделено три подгруппы: 12 детей со сроком беременности 32–33 нед (подгруппа ГВ32–33), 15 со сроком беременности 34–36 нед (подгруппа ГВ34–36) и 22 со сроком беременности 38–40 нед (подгруппа ГВ38–40).

На основании результатов нейросонографии были сформированы еще две подгруппы: с преимущественно геморрагическим поражением ЦНС с внутрижелудочковыми кровоизлияниями (подгруппа ВЖК, n=14) и с преимущественно ишемическим поражением с перивентрикулярными лейкомаляциями (подгруппа ПВЛ, n=7).

Всем новорожденным проводили клинический осмотр с последующим присвоением баллов по шкале Апгар. Оценку внутренних структур головного мозга осуществляли методом нейросонографии. Тяжесть перинатального гипоксически-ишемического поражения ЦНС определяли согласно классификации перинатальных поражений нервной системы у новорожденных [18].

Количественный анализ концентрации НСЕ в сыворотке крови выполняли методом иммуноферментного анализа со специфическими тест-системами на основе моноклональных антител. Результаты записывали с помощью одноканального фотометра, а уровни НСЕ сравнивали в исследуемых подгруппах и контрольной группе.

Все дети в тяжелом состоянии получали лечение в отделении интенсивной терапии, которое включало различные методы: искусственная вентиляция легких, инфузионная, антибактериальная терапия и глюкокортикоидная терапия. Также они проходили комплексную синдромальную терапию с тщательным контролем состава крови и уровня различных веществ.

Подготовку данных и последующую статистическую обработку проводили в программах Microsoft Office Excel (Microsoft, США) и Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США). Для проверки нормальности распределения использовали критерий Шапиро–Уилка. Наличие выбросов проверяли методом трех сигм. Тест показал нормальность распределения обрабатываемых выборок. Все результаты измерений представлены в тексте и графиках в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±σ). Сравнение между группами в каждой временной точке выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа (англ. analysis of variance, ANOVA) и теста Тьюки. Различия считали значимыми при p<0,05.

В контрольной группе состояние детей при рождении было удовлетворительным, баллы по шкале Апгар варьировались от 8 до 10. В основной группе при рождении у 23 (46,9%) новорожденных было тяжелое состояние, у 18 (36,7%) − средней тяжести, у 8 (16,3%) − удовлетворительное.

У всех детей основной группы были отмечены проявления перинатального гипоксически-ишемического повреждения: у 10 (20,4%) − I степени, у 32 (65,3%) − II степени, у 7 (14,3%) − III степени. У некоторых новорожденных также наблюдались респираторный дистресс-синдром, внутриутробная пневмония, конъюгационная гипербилирубинемия различных степеней, общий отечный синдром и внутриутробная недостаточность питания. С помощью нейросонографии подтверждены внутрижелудочковые кровоизлияния и перивентрикулярная лейкомаляция у 21 ребенка.

В контрольной группе концентрация НСЕ в сыворотке крови не колебалась более 2,7±0,5 нг/мл в течение 24-недельного периода наблюдения. Однако в подгруппах А1–3, А4–6 и А7–9 отмечены статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой на протяжении всего исследования (р<0,05), за исключением подгруппы А7–9 на 24-й неделе.

Примечательно, что значительные различия наблюдались между подгруппами А1–3 и А4–6 в течение 2-й и 3-й недель. После незначительного снижения на 4-й неделе концентрация НСЕ в сыворотке крови детей этих подгрупп вернулась к прежним значениям, составив 35,5±5,9 и 32,2±4,8 нг/мл соответственно. У новорожденных из подгруппы А7–9 также зафиксирована тенденция к увеличению уровня НСЕ, хотя и в меньшей степени, чем в подгруппах А1–3 и А4–6. С течением времени концентрация НСЕ в этой подгруппе постепенно снижалась до нормальных значений, тогда как в подгруппах А1–3 и А4–6 она оставалась повышенной до конца исследования. Подробные результаты представлены на рисунке 1.

У детей, перенесших перинатальное гипоксически-ишемическое поражение ЦНС на 32–33-й неделе беременности (подгруппа ГВ32–33), сывороточная концентрация НСЕ составила 43,4±45 нг/мл в течение 1-й недели. Для сравнения, у новорожденных в подгруппах ГВ34–36 и ГВ37–41 уровни НСЕ были ниже – 26,6±3,0 и 25,1±1,5 нг/мл соответственно. В контрольной группе концентрация НСЕ в сыворотке крови в течение 1-й недели составляла всего 2,5±0,5 нг/мл.

В ходе исследования концентрация НСЕ в подгруппе ГВ32–33 оставалась достоверно выше, чем в контрольной группе, а также в подгруппах ГВ34–36 и ГВ37–41. Однако к концу исследования различия в уровнях НСЕ между подгруппами ГВ34–36 и ГВ37–41 и контрольной группой уже не были статистически значимыми. С 1-й недели наблюдения во всех подгруппах отмечено постепенное снижение показателей содержания НСЕ в сыворотке крови. Однако в подгруппе ГВ32–33 оно прервалось начиная с 3-й недели, а в подгруппах ГВ34–36 и ГВ 37–40 – начиная со 2-й недели: показатели снова увеличились, достигнув наивысшей точки на 4-й неделе. В то же время в подгруппе ГВ32–33 отмечался более выраженный отсроченный рост концентрации НСЕ, который превысил даже исходный уровень и достиг 45,1±3,5 нг/мл.

В дальнейшем во всех подгруппах концентрация НСЕ в сыворотке крови снова снизилась. Однако на 24-й неделе в подгруппе ГВ32–33 продолжало сохраняться статистически значимое повышение уровня НСЕ по сравнению с контрольной группой. Подробные данные приведены на рисунке 2.

На протяжении всего исследования наблюдалась разница в сывороточной концентрации НСЕ между подгруппой ВЖК, подгруппой ПВЛ и контрольной группой (p<0,05). У новорожденных из подгруппы ВЖК указанные различия носили значимый характер в течение всего эксперимента. Однако в подгруппе ПВЛ различия уровней НСЕ по сравнению с контрольной группой не были статистически значимыми на 2-й, 8-й и 24-й неделях исследования (рис. 3).

Не менее интересной представляется динамика изменения сывороточной концентрации НСЕ в данных подгруппах. Вслед за начальным снижением уровня НСЕ на 2-й неделе жизни, наблюдавшимся в подгруппах ВЖК и ПВЛ, он снова повышался начиная с 3-й недели, достигнув пика на 4-й неделе. В подгруппе ВЖК концентрация НСЕ в сыворотке крови вернулась к исходным значениям 35,0±4,9 нг/мл. Однако в подгруппе ПВЛ пиковая концентрация НСЕ была менее выражена, составляя в среднем 11,8±2,2 нг/мл. В дальнейшем уровень НСЕ в подгруппе ПВЛ постепенно снижался, достигнув нормальных значений к концу исследования. Напротив, в подгруппе ВЖК по сравнению с контрольной группой сохранялись статистически значимые различия в сывороточных концентрациях НСЕ.

В настоящее время существуют проблемы в оценке эффективности медицинских вмешательств и программ реабилитации пациентов с поражением ЦНС. При этом своевременно оказанная реабилитационная поддержка таких больных может не только существенно улучшить качество жизни, но и снизить нагрузку на систему здравоохранения в дальнейшем [19]. Для анализа результатов лечения часто используются суррогатные конечные точки, такие как изменения структурных и функциональных показателей и биологических маркеров. Концентрация НСЕ в сыворотке крови может служить суррогатной конечной точкой при оценке реабилитационных технологий после гипоксически-ишемических поражений ЦНС. Диагностическая значимость НСЕ уже подтверждена в крупных клинических исследованиях [20][21].

В нашем исследовании установлено, что тяжесть перинатального поражения ЦНС обратно пропорциональна гестационному возрасту, что может быть связано с незрелостью органов и систем у недоношенных новорожденных, а также осложнениями внутриутробного развития. Обнаружено, что недоношенные дети имеют более низкую резистентность ГЭБ к поражениям ЦНС по сравнению с детьми с нормальным периодом беременности [22]. Другим клинически значимым изменением является отсроченное повторное повышение проницаемости ГЭБ для НСЕ, наблюдаемое через 4 нед после его выхода в периферический кровоток в 1-ю неделю жизни. Это соответствует экспериментальным исследованиям на лабораторных животных с моделью гипоксически-ишемического поражения ЦНС, где наблюдалось повторное и отсроченное увеличение нейроспецифических белков, маркеров нейронов и глии [23][24]. Данный феномен можно объяснить проникновением аутоантител к НСЕ через поврежденный ГЭБ к нейронам и закреплением хронически протекающего нейродегенеративного процесса. Функциональная целостность ГЭБ частично сохраняется при патологии нейронов, что ограничивает выход НСЕ в периферический кровоток.

Практический интерес также представляют различия в профилях высвобождения НСЕ у детей с ВЖК и ПВЛ. Концентрации НСЕ в сыворотке крови у новорожденных с ВЖК были стабильно в 2–3 раза выше, чем у детей с ПВЛ на протяжении всего периода наблюдения. К 8-й неделе уровни НСЕ в подгруппе ПВЛ были аналогичны таковым в контрольной группе. В исследовании рассматривались подгруппы детей, перенесших перинатальное гипоксически-ишемическое поражение ЦНС. На протяжении всего исследования более высокие уровни НСЕ в сыворотке были связаны с более тяжелым перинатальным гипоксически-ишемическим повреждением, о чем свидетельствует оценка по шкале Апгар.

Представленные данные демонстрируют наличие взаимосвязи между уровнем НСЕ и тяжестью состояния новорожденного. Закономерным будет рассмотреть возможность использования указанного биомаркера на еще более раннем периоде наблюдения. Так, результаты отдельных исследований указывают на высокую диагностическую значимость НСЕ в околоплодных водах. Этот биомаркер может служить маркером повреждения нейронов и коррелирует с такими расстройствами, как ВЖК и ПВЛ у плода [25][26]. Однако необходимо провести ряд подтверждающих исследований для широкого внедрения определения уровня НСЕ на этапе беременности, что поможет своевременно оказывать новорожденным должную реабилитационную поддержку.

Результаты исследования позволяют предположить, что нарушение проницаемости ГЭБ происходит при перинатальном гипоксически-ишемическом повреждении ЦНС. Антиген НСЕ выходит за пределы ГЭБ и служит маркером повреждения нейронов. Его концентрация в сыворотке крови может быть измерена для определения степени и характера поражения ЦНС, а также для оценки эффективности реабилитационных методов.